Gladys Knight naît en Géorgie le 28 mai 1944. Elle chante à l'église dès l'âge de quatre ans. À huit ans, Gladys se joint à des membres de la famille pouir former le groupe « The Pips ».
Le groupe enregistre un premier disque en 1957. Plus tard, le nom du groupe devient « Gladys Knight & the Pips ».
En 1966, Gladys et son groupe signent un contrat avec la compagnie de disque Motown. Ils enregistrent quelques chansons à succès. La chanson « Neither One of Us » atteint la deuxième place au palmarès en 1973. La même année, le groupe quitte Motown pour signer avec Buddah.
Gladys Knight & the Pips sont au sommet de leur carrière dans les années 1973 et 1974.
Le groupe se dissout en 1989. Gladys poursuit sa carrière en solo. Elle se produit régulièrement à Las Vegas. En 2006, elle enregistre l'album de jazz « Before Me ».
Gladys Knight a remporté sept Grammy Awards, dont trois avec son groupe The Pips.
Mariages : Jimmy Newman (1960-1964), Barry Hankerson (1974-1979), Les Brown (1995-1997), William McDowell (2001). Gladys a eu deux enfants avec Jimmy et un enfant avec Barry.